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制药产品的研发和制造涉及的复杂过程需要先进的过程分析技术，即使是常规应用。此要求适用于不锈钢和玻璃容器中的大规模制造工艺以及一次性袋子系统。从培养基和缓冲液制备到灭菌和去污染物的过程都需要液体化学浓度、温度监测和控制，以确保最佳的工艺性能。

关键词:折射率;粒度仪;粒度分布

1 介绍

制药产品的研发和制造涉及的复杂过程需要先进的过程分析技术，即使是常规应用。此要求适用于不锈钢和玻璃容器中的大规模制造工艺以及一次性袋子系统。从培养基和缓冲液制备到灭菌和去污染物的过程都需要液体化学浓度、温度监测和控制，以确保最佳的工艺性能。

任何这些步骤的错误都可能导致昂贵的产品损失、产品质量下降或时间和劳动力损失。然而，虽然任何制药生产过程中的每一步都代表着代价高昂的潜在错误的来源，但大多数步骤也可以用作潜在的质量控制点。因此，密切监控制造过程中的关键步骤是良好制造工艺设计的关键部分。

对液体化学品进行有意义的质量控制需要可靠、易于使用、高精度和快速响应时间的分析仪器。目前满足这些要求的在线方法包括pH、电导率和渗透浓度。简而言之，渗透压浓度是溶质浓度的量度，定义为每升溶液中溶质的渗透摩尔数。所有这些可用技术都面临着动态范围、线性度、精度以及检测限（LOD）和定量限（LOQ）的限制。

此外，这些方法都不是液体化学浓度的必不可少的测量。在这里介绍的工作中，介绍了一种基于折射率（IoR）的新仪器，并与pH，电导率和渗透浓度进行了比较。由于作为浓度监测器的导电性特别高，因此要特别注意比较IoR和电导率测量结果。

折射率测量比pH和电导率具有优势，因为IoR是化学浓度的直接测量值，而pH和电导率取决于流体的电子特性。

折射率测量比pH和电导率具有优势，因为IoR是化学浓度的直接测量值，而pH和电导率取决于流体的电子特性。因此，根据定义是化学浓度的间接或推断测量。在制药生产中，IoR可用于上游和下游应用，而此处介绍的结果主要集中在下游缓冲液制备应用中。

传统的折光仪通过将单一波长的可见光照射到与被分析流体接触的棱镜上来工作。流体的loR是使用斯涅尔定律从临界角确定的。对于大多数液体，简单的校准将loR值转换为以ppm或重量%为单位的化学浓度。传统折光仪的局限性在于它们在透射模式下工作，其中光通过流体传播到光学光检测器。这种方法的缺点是光信号受到流体的衍射和吸收效应的影响。

本研究中使用的IoR分析仪在反射模式光学几何下运行。这意味着光从光学窗口的背面（与被分析的流体接触）反射到光学光检测器中。通过这种方式，减轻了浊度、衍射和吸收的德罗加-托里流体效应，并且可以方便地测量不透明流体的浓度。

传统的折光仪通过将单一波长虽然任何制药过程中的每一步都代表了代价高昂的错误的潜在来源，但大多数步骤也可以用作潜在的质量控制点。

为了探索IoR作为质量控制指标的有效性，进行了一系列实验，涉及测量已知浓度的常用缓冲液成分和溶解在水中的细胞培养基成分。将 IoR 测量值与 pH 值、电导率和渗透浓度测量值进行比较。从这些实验中确定，通过IoR测量在准确性，精密度，线性，可检测极限（LOD）和定量限（LOQ）方面提供的数据优于当前测量溶液电导率，pH和渗透压的方法。LOD被定义为与空白值（一西格玛）相比可以测量的物质的最低浓度。在这项研究中，LOQ与LOD的区别在于，在十西格玛的可靠性下可以确定的最低浓度。

2 实验方法

对pH、电导率、渗透浓度和折射率（IoR）进行了比较，以确定常规液体化学浓度测量的最佳方法。测量是在纽约锡拉丘兹的百时美施贵宝试验工厂进行的。pH、电导率和IoR测量都是在线实时进行的。使用取样离线取样进行渗透压浓度测量。电导率、pH和渗透压浓度是根据其在行业中的常见用途选择的，并作为IoR分析仪的基准。

每种技术在不同的操作原理下运行。电导率是电解液或水溶液中每单位距离电导率的测量值，其测量低导电性或非导电性液体的能力受限。溶液的pH值是溶剂化氢离子（H+）活性的量度。渗透压浓度是每升溶液的渗透摩尔数。这里使用的具体方法是“冰点降低”渗透浓度，其中冰点的差异作为添加到溶剂中的溶质的函数产生溶液的浓度值。冰点降低渗透压浓度作为一种响应时间相对较长的离线实验室技术受限。

折射率是一种光学技术，是溶液浓度的直接测量。本研究中使用的IoR装置在反射几何测量中运行;这意味着光从光学窗口的背面反射出来，在分析下与溶液接触并进入光电探测器。这种几何形状的优势是，IoR分析仪可以监测溶液的电子密度，而不会受到浊度、衍射和吸收等其他光学效应的干扰。此外，IoR 仪器在单个探头中包括温度测量，从而提供两个关键过程参数（浓度和温度）的测量。

IoR、电导率和pH测量是连续进行的。将pH和电导率探头放置在流体池中，缓冲化学品在闭环中循环。渗透压浓度测量是离线进行的。制药生产中使用的缓冲液组分被连续添加到各种溶液中。对于溶质的每次增量添加，将折射率的测量值与电导率的测量值进行比较，并比较两种测量方法的数据的准确性，精密度和线性。文中使用的缓冲成分包括添加剂

1.氯化钠加入含有固定浓度磷酸钠的溶液中；

2.柠檬酸钠加入到固定浓度的磷酸单钠溶液中；

3.磷酸单钠添加到氯化钠中；

4.柠檬酸钠加入磷酸钠；

5.HEPES添加到氯化钠中；

6.将聚山梨酯80加到水中；

7.将Triton X-100加到水中。

HEPES，4-羟乙基哌嗪乙磺酸，是一种广泛用于细胞培养的有机化学缓冲剂。选择这七种缓冲剂是为了更好地代表传统的盐缓冲剂和预计将在下游过程中实现越来越多的使用的更新缓冲剂。

对pH值为7的50mM（mM=milliMolar）HEPES溶液进行了检测极限（LOD）和定量极限（LOQ）测量，其中逐渐加入等分的氯化钠。在这些实验中，IoR与电导率、pH值和渗透浓度进行了比较。LOD和LOQ值是根据响应的方均差和每个仪器响应的斜率作为浓度变化的函数计算的。在一组单独的培养基制备实验中，分析了几种化学物质，比较IoR仪器和电导率。其中包括HAM F10、Dulbecco MEM、RPMI 1640、酵母提取物和其他培养基化学品。

3 结果解析

图1是这些研究中使用的IoR分析仪的图像。分析仪由两个流体单元（一个流体单元用于冗余）和数字控制电子设备组成。流体池包含一个小型化的IoR传感器和热电偶，与所分析的液体化学品接触。数字电子盒对原始光信号、IoR 的实时温度浓度进行分析，并输出 IoR 或液体化学浓度。图2至图5是代表本文研究的所有缓冲液制备过程的结果的数据图表。

图2显示了本研究中为混合缓冲盐溶液而获得的典型数据示例。图中，pH、电导率和IoR与NaPO4（磷酸钠）浓度的关系图。通过将 20 mM 的 NaPO4 加标添加到 1 升 NaCl（钠溶液）中 10 次以达到氯化钠中 200 mM 磷酸单钠的总浓度来进行测量。pH值对NaPO4浓度变化的响应不足。

电导率和IoR均对NaPO4浓度变化表现出出色的响应。与其他缓冲液化学品一样，IoR表现出比电导率更高的线性度，并且与电导率的R2值0.98相比，最小二乘（R2）拟合置信度为1.00。在所有测试的缓冲溶液中，IoR 的线性度都较高。

图 3 显示了 pH 值、电导率和 IoR 与 HEPES 浓度的函数关系。pH和电导率都不能有效地监测HEPES浓度。电导率数据与HEPES浓度呈线性关系;但是，斜率为负。为了获得适当的电导率响应，电导率应随着HEPES浓度的增加而增加。负斜率可以解释为，随着HEPES浓度的增加，溶液的离子变得越来越少，因此电导率降低。对于适当的浓度响应，人们可以预期随着HEPES浓度的增加，电导率值也会增加，就像图2中的盐溶液一样。

因此，电导率无法测量HEPES浓度，因为HEPES是一种非离子溶液，电导率探头在整个HEPES浓度范围内提供了错误的HEPES浓度读数。电导率也无法测量聚山梨酯80和Triton X-100。IoR在所研究的整个浓度范围内以高度线性测量HEPES浓度。

图4显示了IoR和电导率与聚山梨酯80（P80）浓度的函数关系。将 P80 以 1 mL 加标添加到 1 L NaCl 溶液中。电导率无法测量P80浓度。相比之下，IoR在聚山梨酯80的整个浓度范围内显示出高线性。图5显示，IoR对Triton X-100的表现同样出色，并且电导率无法测量Triton X-100浓度变化。

表A显示了此处研究的缓冲溶液浓度测量的IoR和电导率结果的摘要。折射率显示出高线性度，能够测量整个动态范围的所有测试缓冲溶液。电导率测试方法无法测量七个缓冲过程中的五个。此外，IoR 的浓度测量精度为 ±10 ppm，而电导率的浓度测量精度为 ±100 ppm。

图 6 显示了此处评估的每种技术的 LOD 和 LOQ。这些结果表明，IoR分析仪在电导率、pH和渗透浓度方面具有强大的优势。对于IOR分析仪，LOD和LOQ分别为0.70和2.33。电导率LOD和LOQ比IoR分析仪器差两倍以上，分别为1.76和5.84。

图7显示了培养基制备过程中酵母提取物的IoR分析仪和诱导率的比较。IoR分析仪显示出优异的电导率线性。此处评估的所有其他培养基制备过程均有类似的结果。

对于所有实验，使用折射率（IoR）分析仪测量的溶质浓度在线性（通过数据生成的线的R2测量值）、精度、准确度（确定的最佳最小二乘线性拟合）、动态范围和重现性方面优于电导率测量。

总结：

• 为了测量连续添加NaCl到恒定溶液[NaPO4]中，IoR的浓度测量表现出优异的线性和精度（通过R2值测量）。

• 为了测量将 NaPO4 连续添加到常数 [NaCl] 溶液中，IoR 测量表现出卓越的线性度和精度（通过 R2 值测量）。

• 为了测量HEPES连续添加到恒定[NaCl]溶液中，IOR的浓度测量表现出卓越的线性，精密度和特异性。由于向溶液中添加HEPES的电导率产生的线斜率大部分是平坦的，实际上略有负值，因此电导率测量对缓冲溶液中的HEPES几乎没有特异性。

• 为了测量柠檬酸钠连续添加到恒定 [NaPO4] 溶液中的测定，IOR的浓度测定显示出远超的线性（电导率测量是非线性的）、精度和范围。

• 对于连续添加聚山梨酯 80 到水中的测量，IoR 的浓度测量表现出卓越的线性、精密度和特异性。

• 对于针对 pH、介导率和渗透浓度的 LOD 和 LOQ 实验，对于定量限和检测限，IoR 的灵敏度是电导率的 2.5 倍，是渗透浓度的 4.2 倍，是 pH 的 28.6 倍。

• 对于连续增加的复杂介质浓度，通过IoR进行测量表现出优异的线性度和精度，生成的数据的R2值更高。

4 讨论

这些实验表明，与pH值、电导率和渗透压相比，通过折射率测量工艺流体是制药制造中实时、在线质量控制的可行和卓越的手段。此外，实验表明，目前可用的基于IoR的设备比目前可用的测量其他流体参数（如电导率、渗透压浓度和pH值）的流体测量设备表现出更大的线性和精度，以及更低的可检测性和定量水平。他们还表明，与电导率和pH值相比，通过折射率测量显示出更大的特异性和相关性，用于测量含有它们的任何缓冲液或生长介质中阴离子溶质的浓度。由于非离子溶质不影响电导率或pH值，因此在测量制备溶液中此类溶质的含量时，这些特性的测量提供的信息很少。此外，含有两性离子（偶极离子）的溶液（如HEPES）的行为是高度不可预测的;因此，使用pH和电导率来测量两性离子溶液成分的浓度也不是最佳的。这些属性（非离子溶液和含有两性离子（偶极离子）成分的溶液具有卓越的精度、线性和特异性，使得折射率测量适用于制药生产中必不可少的许多缓冲液和细胞培养基的质量控制。

此外，IoR 也可能是验证发酵和分离罐的在线清洗 （CIP） 解决方案的高度相关指标。与电导率的比较尤其基于对改进实时、原位浓度监测和控制的需求。事实上，在几乎所有情况下，IoR都是用于浓度测量的优于电导率的方法。

然而，传统的IoR受到其无法指定化学混合物的限制。因此，近红外（NIR）和傅里叶反式红外光谱（FTIR）等吸收光谱技术是用于复杂化学混合物的强大集中形态分析工具。

通过 IoR 进行测量还有其他优势。由于折射率测量只需要一束从工艺流体表面反射的光。因此，它有效地消除了流体采样造成的任何潜在污染风险，或由于施加电压电位或其他测量方式而对敏感介质内容物的潜在损坏。此外，折射率测量几乎是瞬时的，而其他方法（如采样）需要更多时间。测量折射率也更有可能减少人为误差。

这并不是说折射率测量与其他质量控制指标相比没有缺点。具体而言，传统的IoR测量多组分流体混合物的平均浓度，并且缺乏指定所述混合物中特定组分浓度的能力。IoR 也取决于温度，最先进的 IoR 分析仪具有实时温度补偿作为内置功能。不能推断折射率测量在所有情况下都应取代pH、电导率或渗透浓度的测量。

相反，pH值虽然目前是一个不太准确的测量指标，但它仍然是流体的物理特性，其本身会对产品质量产生非常直接的影响。溶液的渗透浓度或电导率也可能直接影响产品产量和质量;但是，并非在所有情况下都是如此。事实上，鉴于许多缓冲液和营养培养基的关键成分是阴离子的，因此，对电导率完全没有影响，因此很容易争辩说，在这种情况下，折射率将是一个与整体产品质量更直接相关的指标。

同样，两种非常不同的溶质的等摩尔量可以产生相同的渗透压浓度读数，因此渗透压浓度测量无法检测到两种溶质之间的差异。这两种不同的溶质不太可能给出相同的渗透压浓度读数，也不会给出相同的IoR读数。因此，对于许多应用，工艺流体折射率的测量很可能可以替代其他指标，而对于其他应用，它更恰当地可能是通过其他物理参数进行测量的补充。在许多情况下，额外的指标可能是保障产品质量和产量的关键指标。

IoR作为过程质量控制指标的其他应用仍有待研究，但可能具有巨大的潜力。折射率的卓越灵敏度可能使其在测量最终产品的浓度和/或质量方面具有潜在价值。不太可能是折射率检测内毒素等杂质的能力。在制药领域之外，IoR也可能是一个有益的指标。IoR 的其他应用包括相关行业，如微芯片制造、塑料、食品加工、酿造、酿酒和化妆品。但对于所有这些应用，IoR 将提供相同的功能——与电导率测量相比，具有更高的精度、精度和线性度。