扫描电镜制样方法｜5种常用的生物样品干燥方法

扫描电镜在观察生物样品时，具有以下特点：多角度观察样品的表面结构；不需要将样品切成薄片；景深大、图像立体感强；放大倍数从几十倍到几十万倍连续可调；在观察形貌的同时可以对微区的成分进行定量和定性分析。而能否获得真实、清晰、理想的扫描电镜观察结果，样品的制备过程是关键。

生物样品含水直接观察，会对扫描电镜造成以下影响：

1.  样品蒸发的水蒸气遭遇高能电子束，会被电离而放电，引起束流大幅度波动，使图像模糊，或者根本不能成像;

2.  大多数含水样品在高真空中容易发生形态损伤，表面皱缩、变形; 

3.  样品挥发会造成镜头、光阑等的污染; 

4.  灯丝会被上升水蒸气氧化而变质。

生物样品的含水量高，二次电子产率低，导电性差，对热，电子束敏感，仅有少数样品如毛发、牙齿以及含水量极低的昆虫等可以直接喷镀观察，绝大多数的生物样品均要求经过干燥处理才能镀金观察。

干燥是扫描电镜生物样品制备中的关键环节，如果处理不好，会直接影响到观察的清晰度与准确度。要想制备出好的扫描电镜生物样品，需要在干燥过程中尽可能减少由于水分蒸发而引起的样品表面形貌的形变，且必须确保干燥彻底。大多数动植物容易发生明显的塌陷和变形。因此，需要针对不同的生物样品来选择合适的干燥方法。

扫描电镜生物样品制备常用干燥方法

01  自然干燥法

自然干燥法是指样品中的水分在大气中自然蒸发，或样品经脱水处理后脱水剂自然挥发而干燥的方法。

对干种子、果壳、某些干花粉、昆虫标本等来说，自然干燥法是一个简易实用有效的方法，虽然在自然干燥过程中，样品体积有所收缩，但却保留了样品的基本形态。适用于外表坚硬的样品，如外表有壳的昆虫，木材等。

自然风干——飞纳扫描电镜直接观察螨虫

02  烘干干燥法 

烘干干燥法是将要研究的样品用烘干箱烘干，一般温度控制在 80℃ 以下，烘干程度以含水量在 5% 以下为好。此方法的干燥速度较快，但水分蒸发时可能造成样品变形或断裂。适用于不易变形且耐热的样品，比如淀粉粒、孢子粉等。

烘干的花粉喷金后直接可以用二次电子观察

03  临界点干燥法

临界点干燥法是利用物质在临界状态下，液体和气体的密度相等，气液界面完全消失，液体的表面张力系数为零。临界点干燥法之所以一直被视为制作生物医学扫描样品最可靠的干燥方法，是因为此法能消除液体表面张力的作用，干燥出的样品能较大程度地保存其自然形态。

04  冷冻干燥法

冷冻干燥法是将含水样品放入低温环境中冷冻，或使用溶剂将样品中的水逐级替换后冷冻，然后抽真空升华。它是利用低温和真空，使样品中的水分或溶剂直接升华，以达到干燥样品的目的。冷冻干燥过程不经过液相阶段，因而避免了气相和液相之间表面张力对样品的损伤。

05  真空干燥法

真空干燥法指的是将经脱水（多用梯度脱水）的样品置于真空容器中进行干燥的方法。真空干燥法选用高熔点的有机溶剂（叔丁醇、乙腈、六甲基二硅胺烷、正丁醇等）作升华介质，既保留了冷冻干燥法的优点，又不用对样品进行冷冻处理，无冷冻损伤，且操作简单。适用于所有生物样品，特别是细菌、细胞等微小样品。

经过梯度脱水真空干燥的杆菌可以轻松获得高倍图像

小结

干燥方法在不断改进，但还是只能把由干燥引起的样品变形控制在一定的范围内。上述 5 种干燥方法各有优缺点，且各有适用的生物样品种类。我们在选择生物样品干燥的方法时，尽量选择能保持样品表面真实结构的方法，在保证扫描电镜状态下，尽量还原样品表面细节。

对于生物样品，飞纳电镜低真空模式可以直接观察一些生物样品，如新鲜植物叶片，昆虫等。观察叶子气孔，高亮度的 CeB6 灯丝可以在低曝光时间下快速拍照，获得高质量图像，避免了长时间曝光导致气孔关闭以及长时间抽真空导致叶片失水收缩。

飞纳电镜低真空下观察叶子气孔

此外，飞纳电镜的专用控温样品杯可以控制样品温度，进而改变样品周围的湿度，最大限度地降低电子束和真空度对样品的损坏。适用于一些含水较高的水凝胶，蛋白，藻类等样品，在冷冻状态下，不脱水，背散射直接观察，可以保持样品的原始形貌结构。

冷冻的水凝胶，观察到其大范围内，短程有序，长程无序