本文由马尔文帕纳科粒度应用专家刘晓华供稿

仪器：Zetasizer Ultra纳米粒度电位仪

样品池：使用小体石英样品池(ZEN2112)测量样品。使用MADLS测量颗粒浓度，可以得到粒径大小分布和每个峰的浓度。测量时，需要用户提供以下参数：

• 样品材料：因为病毒衣壳是由蛋白质外壳制成，测量是以蛋白质作为样品材料。

• 分散剂材料：最初分散剂设置为水，但随后通过编辑颗粒浓度结果来修正粘度以获得正确的尺寸和浓度。测量粒度的准确性对颗粒浓度的计算至关重要。缓冲液的粘度是用玻璃微珠来测量的^[1]。需注意，较大的颗粒散射更多，无需向样品中大量添加。

• 缓冲散射计数率(背向散射角)：缓冲散射强度在用于测量的同一样品池(ZEN2112)中测量，只需使用背向散射角设置单角度测量，并将测量位置设置在比色皿的中心。作为正常测量运行，导出的计数率值用于“缓冲散射”领域的颗粒浓度测量。

三次重复测量的运行时间小于4分钟。

02丨测量结果

三种AAV样品的粒径大小分布如图1，图A至C所示。相应的颗粒浓度如图2，图D至F所示。图1，图A所示的ATCC AAV2参考样品含有聚集体，这并不奇怪，因为该样品是从冷冻中解冻的，由于可用体积小，直接插入试管中，没有任何预过滤。然而，尽管存在聚集体，基于MADLS技术测量的颗粒浓度给出了一个浓度值(1.12 x 10¹²颗粒/ml)与衣壳酶联免疫吸附试验(0.92 × 10¹²粒/ml)相关良好。关于浓度更多细节见表1。对于Allergan的两个AAV样本，检测到的聚集物少得多或为零，从表1中可以看出，两个样本中病毒峰值的浓度值与衣壳ELISA结果具有良好的相关性。

图1 三个样品中的每一个的三次重复测量如图所示：图A-ATCC AAV2参考样品，图B-Allergan AAV样品1和图C-Allergan ADP样品2

图2 与图1中相同的三个样品的三次重复测量的分布颗粒浓度：图D-ATCC AAV2参考样品、图E-Allergan AAV样品1和F-Allergan ADP样品2

为了比较变化，取每次重复测量的浓度结果，计算标准差和平均值，以此计算%CV。

表1 三个样品的衣壳ELISA测定浓度数据和基于MADLS的颗粒浓度结果；ATCC AAV2参考样品、过敏原样品1、过敏原样本。2、所有浓度均以颗粒/毫升为单位。n=表示在三次重复测量中，有几次测到了峰值。如果不存在群体峰值，则标注为n/a，即“不适用”。

比较表1的结果，ATCC AAV2参考样本的病毒种群浓度值CV %最大。这是由于样品中的聚集体影响了AAV峰值的确定程度。如果您将图1A中的大小峰值可重复性与图1B或1C中的其他病毒种群峰值进行比较，您可以看到后者覆盖得更好，可重复性更高。这将直接影响浓度测量的重复性。两种Allergan AAV样品的峰值重复性约为15%，样品中没有或只有少量聚集物。      

结论：

所提供的数据表明，Zetasizer Ultra基于MADLS的颗粒浓度既可以提供AAV病毒样本的大小分布，从而报告样本聚集状态，也可以提供有关主要病毒群的浓度和存在的任何聚集的信息。每次重复测量不超过4分钟，样品可以在试管内进行整个测量，因此污染的风险最小，暴露给操作人员的风险也最小。

作为最后的注意事项，在测试期间，确定使用正确的样品粘度以确保最准确地测量颗粒浓度是很重要的。分散剂的粘度可以用粘度计测量，也可以在Zetasizer Ultra仪器中使用粒径参考珠来测量^[1]。    

参考文献：

[1] Determining Dispersant Viscosity Using Dynamic Light Scattering; Malvern Panalytical Application Note