纳米颗粒示踪分析（NTA）以高分辨率、逐个颗粒分析而闻名，但我们所说的“高分辨率”究竟是什么意思呢？这篇技术文章探讨了Nanosight Pro绘制分布数据使用的两种方法，旨在提高多分散颗粒分析的置信度。

在NS Xplorer 软件的视野内，可以看到颗粒布朗运动下的移动。软件默认记录5个750帧的视频，然后逐帧识别并追踪可视颗粒中心点。软件计算每颗粒子沿X和Y平面移动的平均距离，从而计算均方位移（MSD）。随后，通过Stokes-Einstein 方程将MSD转化为流体动力学直径（d_h）。

NS Xplorer（以及以前的NTA软件版本）算法必须通过追踪粒子足够步数的布朗运动，以准确确定步长的平均值，从而获得流动力学粒径。然而，小颗粒受散射体积和它们在视野内保持的有限时长（例如，在每秒30帧（fps）的情况下，<10帧=0.3s）所限制。这些局限性偶尔会表现为粒径分布的人为展宽，而平均粒径仍保持准确。

为了解决这个问题，NS Xplorer和NTA软件采用了一种数学模型来补偿布朗运动中的有限轨迹（Saveyn等人，2010）。该模型被称为“有限轨迹长度调整（Finite track lengh adjustment, FTLA）”。FTLA补偿了增宽效应，并呈现调整后的分布宽度（图1）。

图1：FTLA模式适用于包含多个离散并可分辨群体的样品。FTLA进一步帮助获取100nm乳胶球的单分散粒径分布。

FTLA通常适用于单分散样品或者具有双峰或三峰混合离散群体的多分散样品。原始信号数据分析模式RAW分布则为更多的多分散样品提供了更深入的见解，并确保在更复杂的系统中具有良好的测量再现性。

图2显示了FTLA (蓝色)和RAW（红色）分布，RAW分布模型下，复杂样品的多分散性增加。Raw模型反映了样品的“真实”异质性，具有较宽的粒径分布，但不会影响主分布的单个肩峰的分辨率。

图2：RAW模型（Red）适合连续粒径分布的多分散样品

下图进一步说明FTLA和RAW分布如何影响数据的再现性。

图3：RAW和FTLA呈现的外泌体粒径分布

图4：外泌体FTLA粒径分布展示出低再现性

RAW分析可能更适合多分散族群，而FTLA可能更着重离散族群从而降低测试之间的可重复性（图4）。

FTLA算法基于预测每个粒子在无限长时间内的单个路径长度，提供窄的粒径分布峰。FTLA算法将大小相似的颗粒分组到不同分布组距。然而，当样品高度多分散时采用FTLA模型更具挑战性，因为不同的粒径使组距之间的区分变得更复杂。在FTLA模型下，最终的分布图不同测量的最终分布图看起来重复性差。绘制RAW分布可以减轻这种变化，从而在许多测量中具有更好的再现性（图5）。

图5：外泌体RAW粒径分布展现出高再现性

FTLA和RAW模式对评估离散族群都有帮助。RAW分布可能呈现出一个单峰，该峰可能看起来像主组群一侧的肩峰。从RAW切换到FTLA进一步证实主峰中第二个峰的存在，表明样品中很大一部分颗粒粒径更大（图7）。

图6：纳米气泡的RAW粒径分布

图7：纳米气泡的FTLA粒径分布

总结

下表总结归纳了使用纳米颗粒示踪分析粒径分布时，该如何在FTLA或RAW分析模式中做出选择，供广大用户参考。