关键词：BSA、流动模式、高分辨率粒径测试

传统纳米粒度仪基于动态光散射技术，使用一束激光照亮样品，通过光电检测器检测悬浮在液体中颗粒的布朗运动造成的散射光的波动。原始的散射光光强随时间的波动信号通过相关性计算得到体系的相关曲线，进而通过不同的数学模型，如累积法或者多指数法得到颗粒的粒径和粒径分布。纳米粒度仪广泛采用比色皿测试模式（文献中常称作batch mode），对于宽分布样品的粒径分布分辨率较低，且分布结果极度依赖于算法，极限分辨只能达到区分粒径相差2.5-3倍的窄分布单独组分，这极大地限制了粒径分布结果的定量性。

动态流动模式通过与前端分离设备相连接使用，分别检测每一个流出组分的粒径，原则上讲每一个流出组分都是单分散或接近单分散的，再通过浓度检测器得到的信号，就得到了不依赖于算法的真实粒径分布，其分辨率可以达到或者优于1.2倍粒径分辨率。

在本应用中，我们将BeNano主机与SEC前端相连接，检测了BSA的粒径和粒径分布信息。

原理和设备

采用丹东百特仪器有限公司的BeNano 180 Zeta Pro纳米粒度及Zeta电位分析仪，仪器使用波长671 nm，功率50 mW激光器作为光源，在173°进行光散射信号收集。测试使用了27μL 低容量流通池作为样品池。利用BFC-1信号采集器收集前端SEC设备的示差折光检测器的输出。

样品制备和测试条件

在PBS缓冲溶液中，配置浓度为5mg/mL的BSA溶液，通过前端SEC（含有RI检测器）进行进样，分离。分离后的样品组分逐一进入BeNano进行粒径检测。

测试结果和讨论

图1. BSA样品光强、RI和粒径流出曲线

由图1中流出曲线可以看出，BSA流出曲线为多峰曲线。较早的流出峰（6分钟左右）为团聚物峰，8-10分钟为被分离的寡聚体峰。由于最后一个主峰为BSA的单体峰，可以依次推测出之前的峰分别为二聚体、三聚体和四聚体峰。主峰面积较大，说明大部分蛋白为单体。由粒径流出曲线（红点）可以看出，检测到的粒径从大到小逐渐流出，这与SEC分离的原理相一致！这既证明了前端SEC对于样品分离效果良好，也证明了BeNano作为SEC的一个检测器，有效得到了各个流出组分的粒径信息。

图2.BSA样品柱状光强分布曲线

图3.BSA样品光强分布曲线连线图

图2和图3中，将色谱流出曲线转化为粒径光强分布曲线，可以通过曲线中看出明显被分离的寡聚体粒径，其中单体为7.16nm，这与BSA理论单体尺寸（~7nm）具有极好的符合度。其他组分的尺寸和面积列于表1中。

表1. BSA分布峰结果

图4.单机模式BSA样品光强分布曲线图

图5. 单机测试（连线图）和流动模式测试（柱状图）粒径光强分布曲线

通过图4单机模式检测的BSA溶液粒径光强分布图可以看出，单机模式下仅能分辨出两个峰，通过图5的BSA流动模式和单机模式检测结果可以看出，流动模式可以将多个混合的组分分辨出来，极大的提升了粒径测试的分辨率。其中在小粒径峰内成功的辨认出粒径差别极小的寡聚体组分。

结论

BeNano流动模式是将BeNano作为一个检测器与前端分离装置连用的测试模式，其目的是为了有效提升样品粒径测试的分辨率。在这个应用报告中，我们通过检测BSA样品，展示了BeNano流动模式的检测能力，充分证明了其在高分辨率粒径测试领域的发展潜力。